Nutraceuticals as a Novel Strategy to Modulate Inflammation in In Vitro Macrophages Derived from Childhood Cancer Survivors

Le terapie antitumorali attualmente disponibili hanno migliorato il tasso di sopravvivenza dei bambini affetti da cancro, rendendoli lungo-sopravviventi da tumore pediatrico (LSTP), tuttavia tali terapie determinano effetti collaterali a breve e lungo termine. La chemioterapia e la radioterapia causano uno stato infiammatorio di basso grado, responsabile dell’"Inflamm-aging", che si traduce nell'insorgenza di malattie croniche normalmente associate all'invecchiamento. Per contrastare e prevenire l'"Inflamm-aging" nei LSTP, è necessaria la ricerca di nuove strategie terapeutiche con minori effetti collaterali. I macrofagi sono cellule immunitarie che possono presentarsi in due diverse polarizzazioni fenotipiche: macrofagi classicamente attivati (M1) con proprietà pro-infiammatorie e macrofagi alternativamente attivati (M2) con proprietà anti-infiammatorie. Queste cellule sono coinvolte nelle risposte immunitarie e infiammatorie, con un ruolo chiave anche nel metabolismo del ferro. Durante l'infiammazione, elevati livelli di interleuchina (IL)-6 causano un aumento del rilascio di epcidina, che induce la degradazione della ferroportina-1 (FPN-1), determinando un incremento della concentrazione intracellulare di ferro e contribuendo al peggioramento dello stato infiammatorio. Resveratrolo, Curcumina e olio arricchito con Licopene sono nutraceutici che esercitano effetti anti-infiammatori e antiossidanti. Abbiamo deciso di valutarne gli effetti sull'"Inflamm-aging" e sulla polarizzazione dei macrofagi nei LSTP, suggerendo così un nuovo meccanismo d'azione di questi composti. La ferroptosi è una forma di morte cellulare regolata ferro-dipendente, guidata dalla perossidazione lipidica e dall'inattivazione del pathway GPX4/glutatione. Nei LSTP, la cui omeostasi è già compromessa dai precedenti trattamenti oncologici, la suscettibilità alla ferroptosi può essere notevolmente aumentata, rappresentando un meccanismo poco esplorato nel danno tissutale indotto dalla terapia e nell'invecchiamento accelerato. Abbiamo isolato i macrofagi dal sangue periferico di LSTP e donatori sani (CTR). Abbiamo valutato la polarizzazione dei macrofagi, il metabolismo del ferro, la ferroptosi e lo stato infiammatorio dei macrofagi LSTP mediante Western Blot, saggio del ferro ed ELISA, rispettivamente. Abbiamo studiato gli effetti della somministrazione di nutraceutici sulla polarizzazione dei macrofagi, sul metabolismo del ferro e sull'infiammazione nei LSTP mediante Western Blot, saggio del ferro ed ELISA. Abbiamo rilevato una prevalenza di macrofagi M1, osservando elevati livelli di espressione proteica dei marcatori del fenotipo M1 (CCR7, CD86 e iNOS) nei LSTP. Abbiamo dimostrato un'alterazione del metabolismo del ferro in queste cellule, con elevati livelli degli importatori del ferro DMT1 e TfR1 e bassi livelli dell'esportatore del ferro FPN-1. Abbiamo confermato il peggioramento dello stato infiammatorio nei LSTP osservando un forte aumento del rilascio di citochine pro-infiammatorie (IL-6, TNF-α e IFN-γ). Inoltre, abbiamo dimostrato un coinvolgimento della ferroptosi nell'”inflamm-aging” e nell'alterazione delle funzioni macrofagiche, osservando livelli di espressione ridotti di GPX4, SLC3A2, SLC7A11 e HMGB1. La somministrazione di nutraceutici ha indotto uno switch dei macrofagi verso il fenotipo anti-infiammatorio M2 e una riduzione del rilascio di citochine pro-infiammatorie. Abbiamo dimostrato per la prima volta che questi composti sono in grado di modulare il metabolismo del ferro, riducendo così la concentrazione intracellulare di ferro. La prevalenza di macrofagi M1 e l'alterazione del metabolismo del ferro osservate nei LSTP ci permettono di ipotizzare che essi possano essere responsabili del peggioramento dell'infiammazione. Proponiamo pertanto i macrofagi, il metabolismo del ferro e la ferroptosi come nuovi bersagli terapeutici per contrastare l'"Inflamm-aging" nei LSTP. Inoltre, abbiamo dimostrato per la prima volta che i nutraceutici contrastano l'infiammazione nei macrofagi dei LSTP modulando il metabolismo del ferro, suggerendo così un nuovo meccanismo d'azione.

Although currently available cancer therapies have improved the survival rate of children with cancer by making them Childhood Cancer Survivors (CCS), these therapies determine long-term side effects. Chemotherapy and radiotherapy cause a low-grade inflammatory state, responsible for “Inflamm-aging”, which results in the onset of chronic diseases normally associated with aging. To counteract and prevent “Inflamm-aging” in CCS, the research of new therapeutic strategies with fewer side effects is needed. Macrophages are immune cells which can be present in two different phenotype polarization: classically activated macrophages (M1) with pro-inflammatory properties and alternatively activated macrophages (M2) with anti-inflammatory properties. These cells are involved in immune and inflammatory responses, with a key role also in iron metabolism. During inflammation, high levels of interleukin (IL)-6 cause an increase of hepcidin release, which induces ferroportin-1 (FPN-1) degradation, leading to an increase of intracellular iron concentration, contributing to the impairment of the inflammatory state. Resveratrol, Curcumin and Oil-enriched Lycopene are nutraceuticals which exert antiinflammatory, and antioxidant effects. We decided to evaluate their effects on “Inflamm-aging” and macrophage polarization in CCS, thus suggesting a novel mechanism of action of these compounds. Ferroptosis is an iron-dependent form of regulated cell death driven by lipid peroxidation and GPX4/glutathione pathway inactivation. In CCS, whose redox homeostasis is already compromised by prior cancer treatments, ferroptotic susceptibility may be substantially heightened, representing an underexplored mechanism in therapy-induced tissue damage and accelerated aging. We isolated macrophages from peripheral blood of CCS and healthy donors (CTR). We evaluated macrophages polarization, iron metabolism, ferroptosis and inflammatory state of CCS macrophages by Western Blot, Iron assay and ELISA, respectively. We investigated the effects of nutraceuticals administration on macrophage polarization, iron metabolism and inflammation in CCS by Western Blot, Iron assay and ELISA. We revealed a prevalence of M1 macrophages - observing high expression levels of M1 phenotype markers (CCR7, CD86 and iNOS) – in CCS. We demonstrated an alteration of iron metabolism in these cells, with high levels of the iron importers DMT1 and TfR1 and low levels of the iron exporter FPN-1. We confirm the impairment of inflammatory state in CCS by observing a strong increase of pro-inflammatory cytokines release (IL- 6, TNF-α, and IFN-γ). Moreover, we demonstrated an involvement of ferroptosis in inflamm-aging and alteration of macrophage functions, observing lower expression levels of GPX4, SLC3A2, SLC7A11 and HMGB1. Nutraceuticals administration induced a macrophage switch towards the anti-inflammatory phenotype M2 and a decrease of proinflammatory cytokines release. We demonstrated for the first time that these compounds are able to modulate iron metabolism, thus decreasing intracellular iron concentration. The prevalence of M1 macrophages and the alteration of iron metabolism observed in CCS let us suppose that could be responsible for the worsening of inflammation. Therefore, we suggest macrophages, iron metabolism and ferroptosis as novel therapeutic targets to counteract “Inflamm-aging” in CCS. Moreover, we demonstrated for the first time that nutraceuticals counteract inflammation in CCS macrophages by modulating iron metabolism, thus suggesting a novel mechanism of action.