p57 phosphorylations: importance in protein stability, localization, and interactions

p57Kip2 (p57) è una proteina di 316 aminoacidi codificata dal gene CDKN1C. È un inibitore delle chinasi ciclina-dipendente (CKI) appartenente alla famiglia CIP/Kip, che comprende anche p21CIP/Waf1 e p27Kip1. È stata identificata per omologia di sequenza con gli altri membri, ed è la proteina CIP/Kip meno studiata. Strutturalmente, p57 condivide con le altre CIP/Kip un dominio molto conservato nella regione N-terminale chiamato Kinase Inhibitory Domain (KID), necessario e sufficiente per il legame e l’inibizione dei complessi ciclina/CDK principalmente nella transizione G1/S, quali ciclina D/CDK4(6) e ciclina E(A)/CDK2 (Besson et al., 2008). Nella regione C-terminale p57 presenta, in analogia con p21, un dominio di legame a PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) e, in analogia con p27, il dominio QT (Glutammina, Treonina) coinvolto in interazioni proteina-proteina per lo più CDK-indipendenti. Diversamente dagli altri membri della famiglia e dalla proteina di topo, p57 umana presenta una regione centrale che è costituita da una sequenza altamente ripetuta di residui di prolina e alanina ("PAPA region”), la cui funzione, non ancora definita, è stata associata alla possibilità di interazione con diversi partner. In un precedente lavoro del gruppo di ricerca presso cui ho svolto la mia tesi, è stato identificato un NLS nella regione C-terminale della proteina, definendo un NLS bipartito per p57 umana (Stampone et al., 2021). Per molto tempo l’importanza funzionale di p57 è stata associata ad un ruolo centrale nel processo di embriogenesi. Infatti, p57 è l’unico CKI che si è dimostrato essere essenziale durante l’embriogenesi (Yan et al., 1997; Zhang et al., 1997; Takahashi et al., 2000), come evidenziato dal fatto che i topi Cdkn1c -/- muoiono immediatamente dopo la nascita a causa di dispnea dovuta a gravi anomalie dello sviluppo (Yan et al., 1997). Inoltre, alterazioni nel gene umano CDKN1C hanno un’importanza funzionale nella patogenesi di diverse sindromi dell’accrescimento come la sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (Brioude et al., 2015), IMAGe (Arboleda et al., 2012) e Silver Russell (Binder et al., 2020). Queste osservazioni hanno contribuito a definire un ruolo chiave per p57 durante lo sviluppo embrionale, nei processi di “cell commitment”, di differenziamento cellulare e di mantenimento dell’omeostasi cellulare (Stampone et al., 2018). A differenza delle altre proteine CIP/Kip, p57 non è ubiquitariamente espressa e la sua presenza è limitata a tessuti e organi specifici quali polmone, rene, pancreas, testicoli, placenta, sistema nervoso e muscolo scheletrico. Inoltre, p57 risulta ridotta in molti tumori (Borriello et al., 2011). Di conseguenza, dato il suo ruolo come inibitore dei complessi ciclina/CDK, è stata considerata una proteina con attività di oncosoppressore (Coley et al., 2012). p57 è una proteina intrinsecamente non strutturata (IUP), una caratteristica che le permette di adattarsi a numerosi interattori (Creff et al., 2020). In quanto IUP, la sua localizzazione, stabilità e capacità di legare partner funzionali possono essere fortemente modulate dalle modifiche post-traduzionali. A generare questo tipo di complessità concorrono le modifiche post- traduzionali che ne modulano anche la localizzazione e la stabilità. Attualmente pochi dati sono disponibili sulla regolazione post-traduzionale della proteina. Dati di letteratura, insieme a quelli ottenuti nel nostro laboratorio, hanno evidenziano come p57 presenti diverse modifiche post-traduzionali. In particolare, in un lavoro pubblicato dal gruppo di ricerca in cui è stato condotto il presente studio, è stato dimostrato che, nella linea cellulare di leucemia mieloide cronica, K562, p57 è prevalentemente fosforilata e può essere considerata una fosfoproteina (Borriello et al., 2011). Pertanto, l’identificazione e la caratterizzazione funzionale delle fosfoisoforme della proteina appaiono di fondamentale importanza per comprenderne le funzioni di p57. A tal fine, in questo lavoro di tesi, è stato caratterizzato il pattern di fosforilazione di p57. È stato caratterizzato in modelli cellulari tumorali e non, nonché in cellule asincrone e sincronizzate nelle diverse fasi del ciclo, attraverso analisi di elettroforesi bidimensionale seguita da immunoblotting (2D-SDS-PAGE/IB). La presenza di pattern bidimensionali di p57 simili in diverse linee cellulari suggerisce il mantenimento delle principali isoforme fosforilate della proteina in diversi fenotipi. Inoltre, numerose isoforme associate a mono, bi- e trifosforilazioni sono state evidenziate. L’analisi bidimensionale ha permesso anche di dimostrare chiare differenze nella distribuzione delle fosfoisoforme nei compartimenti citosolico e nucleare, sia in cellule asincrone sia sincronizzate. In particolare, la forma non modificata è rilevabile solo nel nucleo, mentre le forme più acide sono presenti nel citoplasma. L'assenza della forma non modificata nel citoplasma e la diversa distribuzione delle fosfoisoforme di p57 ci ha permesso di ipotizzare che lo stato di fosforilazione della proteina possa modularne la traslocazione nucleare/citoplasmatica e/o che le diverse fosfoisoforme controllino specificamente processi distinti nei due compartimenti cellulari. Pertanto, appare probabile che p57 possa svolgere ruoli distinti in base al suo stato di fosforilazione e al compartimento cellulare in cui si trova. L’identificazione delle fosfoisoforme di p57 che legano le CDK coinvolte nelle transizioni G1/S e G2/M è risultata cruciale. Studi precedenti hanno mostrato che p57 inibisce l’attività chinasica di diversi complessi ciclina– CDK con differente efficacia (Creff et al., 2020) e considerando che distinte isoforme fosforilate di p57 sono associate a differenti complessi ciclina/CDK, questo potrebbe contribuire a spiegare gli effetti eterogenei di p57 sull’attività chinasica. È stato inoltre dimostrato che lo stato di fosforilazione di p57 influenza la stabilità della proteina regolandone la sua degradazione e lo shuttling nucleo-citoplasma, rendendo possibile la sua interazione con diversi interattori proteici noti, quali LIMK1 e CRM1 (Stampone et al., 2024). Tutte le proteine CIP/Kip partecipano al controllo della dinamica dell'actina, inibendo a diversi livelli la via di segnalazione RhoA/ROCK/ LIMK1. In particolare, per la PAPA region di p57 è stata ipotizzata una funzione regolativa dell’interazione con diversi partner, come per LIMK1 (Vlachos et al., 2009). Inoltre, è stato proposto che la delocalizzazione citoplasmatica di p57 possa essere dovuta al legame con CRM1. Al fine di identificare le isoforme di p57 coinvolte in tali interazioni, esperimenti di co-trasfezione e successive immunoprecipitazioni di LIMK1 e CRM1 sono state eseguite. Dagli esperimenti di co-immunoprecipitazione seguiti da analisi 2D/WB, per l’identificazione delle isoforme di p57 che interagiscono con le due proteine, è emerso che esiste una specificità nella fosforilazione della CKI. Infine, sono stati eseguiti esperimenti mirati all’identificazione dei residui amminoacidici potenzialmente fosforilabili e la loro caratterizzazione funzionale. Attraverso un’analisi di predizione in silico della sequenza codificante di p57 umano sono stati individuati residui di Serina, Treonina e Tirosina con alta probabilità di essere fosforilati. Sulla base dei dati ottenuti, per ottenere informazioni sul ruolo delle diverse fosfoisoforme, è stata effettuata una mutagenesi sito-specifica sostituendo i residui presumibilmente fosforilabili con alanina, al fine di generare varianti non fosforilabili.

p57Kip2 is a 316-amino-acid protein encoded by the CDKN1C gene. It is a cyclin-dependent kinase inhibitor belonging to the CIP/Kip family, which also includes p21CIP1/Waf1 and p27Kip1. It was originally identified by sequence homology with its siblings. P57 is the least studied CIP/Kip protein so far. Structurally, p57 shares with the other CIP/Kip proteins a highly conserved domain in the N- terminal region called the Kinase Inhibitory Domain, which is necessary and sufficient for binding and inhibiting cyclin/CDK (Cyclin-Dependent Kinase) complexes. CIP/KIP proteins act on different cyclin/CDK complexes principally active in G1 phase and in G1/S by targeting the complex cyclin D/CDK4(6) and cyclin E(A)/CDK2), and they work in G2/M by inhibiting cyclin B/CDK2 (Besson et al., 2008). In the C-terminal region, p57 contains, similarly to p21, a PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) binding domain and, similarly to p27, the QT (Glutamine, Threonine) domain, involved mostly in CDK-independent interactions. Unlike the other members of the family and unlike the mouse protein, human p57 has a central region composed of a highly repeated sequence of proline and alanine residues (“PAPA region”), whose function, still undefined, has been associated with the possibility of interacting with different binding partners. In a previous work from the research group where I carried out my thesis, an NLS was identified in the C-terminal of the protein, defining a bipartite NLS for human p57 (Stampone et al., 2021). For a long time, the importance of p57 has been associated with its central role in embryogenesis. Indeed, p57 is the only CKI that is shown to be essential during embryogenesis (Yan et al., 1997; Zhang et al.,1997; Takahashi et al., 2000) and it is demonstrated by mice lacking Cdkn1c die immediately after birth due to dyspnea caused by severe developmental abnormalities (Yan et al., 1997). Furthermore, alterations in CDKN1C coding sequence are implicated in the pathogenesis of different growth syndromes associated with various developmental defects such as Beckwith-Wiedemann Syndrome (Brioude et al., 2015), Silver- Russell Syndrome (Binder et al., 2020) and IMAGe (Arboleda et al., 2012). These observations helped to define a key role for p57 in embryonic development, in cell commitment processes, in cellular differentiation, and in the maintenance of cellular homeostasis (Stampone et al., 2018). Unlike the other CIP/Kip proteins, p57 is not ubiquitous, and its expression is restricted to specific tissues and organs such as lung, kidney, pancreas, testes, placenta, nervous system, and skeletal muscle. p57 is downregulated in many tumors (Borriello et al., 2011) and given its function as an inhibitor of cyclin/CDK complexes, it has been defined as a tumor suppressor (Coley et al., 2012). It should be noted that p57 is an intrinsically unstructured protein, a characteristic that allows it to adapt to numerous interactors (Creff et al., 2020). Being an IUP, its localization, stability, and binding to functional partners may be strongly modulated by post-translational modifications. The post-translational modifications contribute to this complexity, modulating its localization and stability. Only limited data are currently available regarding the post-translational regulation of the protein. Literature data, together with those obtained in our laboratory, have shown that p57 undergoes several post-translational modifications. Indeed, in a paper published by the research group where the current study was conducted, it was shown that in a chronic myeloid leukemia cell line, K562, p57 is mostly phosphorylated, and it can be considered a phosphoprotein (Borriello et al., 2011). These observations suggest that identifying and functionally characterizing the phospho-isoforms of the protein is of central importance for understanding its functions. Thus, this thesis focused on the characterization of the phosphorylation pattern of p57. It was characterized in tumoral and no-tumoral cell lines as well as in asynchronous and synchronized cells in the different cell cycle phases and subsequently analyzed by bidimensional analysis (2D-SDS-PAGE/IB) and immunoblotting. The presence of similar two-dimensional patterns of p57 in different cell lines suggests the conservation of the main phosphorylated isoforms of the protein in different phenotypes. Moreover, the bidimensional analysis allowed us to also determine the presence of different forms of phosphorylation, from the monophosphorylated to the bis- o tri- phosphorylated isoforms, and it was shown that they differently distribute in the cellular compartments, nucleus and cytoplasm. Specifically, a clear separation of p57 isoforms emerged, with the unmodified form and a monophosphorylated form detected exclusively in the nucleus, while the more phosphorylated forms were particularly abundant in the cytoplasm. The absence of the unmodified form in the cytoplasm and the different distribution of p57 phosphoisoforms allowed us to hypothesize that the phosphorylation state of the protein may modulate its nuclear/cytoplasmic translocation and/or that the different phosphoisoforms specifically control distinct processes in the two cellular compartments. This implies that p57 may perform distinct roles based on its phosphorylation state and the cellular compartment in which it is found. Thus, the identification of the p57 phosphoisoforms that bind to the CDKs implicated in the G1/S and G2/M phase transitions was crucial. Previous mechanistic studies have shown that p57 inhibits the kinase activity of different cyclin–CDK complexes to different extents (Creff et al., 2020) and our finding that distinct p57 phosphoisoforms are associated with different cyclin/CDK complexes might help in explaining the heterogeneous effects of p57 on the kinase activity. Additionally, phosphorylation determines the stability of the protein by determining its degradation and nucleus-cytoplasm shuttling, making it able to interact with recognized interactors, including LIMK1 and CRM1 (Stampone et al., 2024). All the CIP/Kip have a role in regulating the dynamics of actin–myosin stress fibers and inhibit at different levels the RhoA/ROCK/LIMK1 pathway. Specifically, the PAPA region of p57 is reported to interact with LIMK1 (Vlachos et al., 2009). Furthermore, it has been proposed that the cytoplasmic delocalization of p57 may be due to binding with CRM1. Experiments of co-immunoprecipitation followed by 2D/WB analysis from the identification of the p57 phosphoisoforms interacting with the two proteins showed a specificity of binding. As the last step of this study, we perform experiments aimed at identifying the specific residues of p57 that are potentially phosphorylated and their functional roles. Using in silico analysis on the hp57 coding sequence, the more probable phosphorylatable serine/threonine residues have been identified. Based on the in silico prediction, a series of site-directed experiments have been carried out to substitute specific serine/threonine with nonphosphorylatable residues.