STABILITA’ CONFORMAZIONALE DELLA 5’-METILTIOADENOSUNA FOSFORILASI II DA SULFOLOBUS SOLFATARICUS UN ENZIMA IPERTERMOFILO CON PONTI DISOLFURO INTRAMOLECOLARI

""La stabilità conformazionale delle proteine è caratterizzata dalla loro stabilità termodinamica che nella maggior parte dei casi dipende dalla energia libera di stabilizzazione che è determinata dalla differenza tra l'energia libera dello stato nativo e quella dello stato denaturato. Si distinguono due tipi di stabilità proteica: la stabilità termodinamica, che si riferisce alla denaturazione reversibile della proteina, e quella a lungo termine, che invece riguarda la fase irreversibile di inattivazione (1,2). . La scoperta dei microrganismi ipertermofili e dei loro enzimi ha rappresentato una svolta sia dal punto di vista della ricerca di base che di quella applicata. Gli enzimi isolati da questi organismi, infatti, possono essere utilizzati come interessanti sistemi modello per studiare e comprendere l’evoluzione degli enzimi, i meccanismi molecolari elaborati per la termostabilità delle proteine e i limiti superiori di temperatura per la funzione degli enzimi. Inoltre le loro peculiari caratteristiche di stabilità ne fanno ottimi strumenti da impiegare in vari settori della tecnologia chimica, medica e biologica. Tutte le informazioni ottenute dall’analisi comparativa funzionale e strutturale di un numero sempre maggiore di proteine ipertermofile e la controparte mesofila, se non hanno permesso di stabilire regole generali, hanno consentito di delineare alcune caratteristiche di adattamento alle elevate temperature da cui risulta come la stabilizzazione delle proteine coinvolge tutti i livelli gerarchici di struttura, primaria, secondaria e supersecondaria.. Per studiare i meccanismi che regolano la stabilità conformazionale e termodinamica di una proteina è stata utilizzata la 5'-metiltioadenosina fosforilasi II dall’archeon ipertermofilo Sulfolobus solfataricus (SsMTAPII), un enzima che appartiene alla famiglia delle purine nucleoside fosforilasi (PNP), enzimi ubiquitari interessanti, anche da un punto di vista clinico, che svolgono un importante ruolo nel metabolismo dei nucleosidi purinici e nel mantenimento delle normali funzioni cellulari (3). SsMTAPII è un omoesamero con una massa molecolare di 180kDa il cui monomero contiene 7 residui di cisteina. L’enzima è estremamente termofilo, con un optimum di temperatura per l’attività catalitica di 120°C ed estremamente termostabile con una temperatura di fusione apparente di 112°C. La struttura tridimensionale, recentemente chiarita indica che è un trimero di dimeri con tre ponti disolfuro intrasubunità il primo tra Cys138-Cys 205, il secondo tra Cys200 - Cys262 ed il terzo tra Cys259-Cys261 (4-6). Per ottenere informazioni sul ruolo giocato dai ponti disolfuro sulla stabilità e sul folding di SsMTAPII, la stabilità conformazionale dell’enzima nativo e dei suoi mutanti C259S\\\/C261S e C262S è stata studiata mediante esperimenti di denaturazione all’equilibrio indotta dalla temperatura e da cloruro di guanidinio ed è stata analizzata mediante spettroscopia di fluorescenza, dicroismo circolare e calorimetria differenziale a scansione. I risultati ottenuti hanno dimostrato che SsMTAPII è un enzima estremamente resistente alla denaturazione sia chimica che termica che è osservabile solo in presenza di agenti riducenti, mettendo in luce il ruolo determinante svolto dai ponti disolfuro sull’elevata stabilità conformazionale dell’enzima. I dati riportati forniscono il primo esempio di denaturazione reversibile dimostrata per una proteina oligomerica ipertermofila con ponti disolfuro intramolecolari.. ""