CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE E FUNZIONALE DELL’ENZIMA S-ADENOSILMETIONINA SINTETASI DALL’ARCHAEON IPERTERMOFILO PYROCOCCUS FURIOSUS

"L’enzima ATP:L-metionina adenosiltransferasi, più comunemente noto come S-adenosilmetionina sintetasi o MAT (EC 2.5.1.6) catalizza la reazione di biosintesi dell’S-adenosil metionina (AdoMet), a partire da ATP e metionina (1). Il meccanismo proposto per tale reazione è piuttosto insolito sotto vari aspetti: infatti l’ATP viene completamente defosforilato e funge da donatore del residuo adenosilico alla metionina. L’atomo di zolfo nucleofilo della metionina attacca il carbonio 5’ del ribosio dell’ATP, rilasciando il gruppo trifosforico che viene poi scisso enzimaticamente. L’energia per il legame con lo zolfo è ricavata dall’idrolisi di tutti e tre i gruppi fosforici. Nella reazione il fosfato terminale dell’ATP è liberato come fosfato inorganico, mentre l’alfa e il beta fosfato danno luogo ad acido pirofosforico. Diverse evidenze sperimentali hanno dimostrato che il tripolifosfato legato all’enzima, rappresenta un intermedio obbligatorio della reazione ed inoltre è stato dimostrato che l’idrolisi del tripolifosfato ad ortofosfato e pirofosfato è catalizzata dallo stesso enzima S-adenosilmetionina sintetasi, che possiede, quindi, anche una spiccata attività tripolifosfatasica (1). Il prodotto AdoMet, ottenuto dalla reazione catalizzata dalla S-adenosilmetionina sintetasi, è coinvolto in una serie di azioni biochimiche, tra le quali le più note sono quelle relative alla biosintesi delle poliammine, alle reazioni di transmetilazione e ad alcune reazioni di modificazione post-biosintetica del t-RNA (2). . L’enzima, presente ubiquitariamente, è stato studiato e caratterizzato estensivamente in batteri ed eucarioti e recentemente anche in Methanococcus jannaschii un archaeon termofilo (3).. Il lavoro di ricerca si inquadra in un progetto finalizzato sia alla comprensione delle basi molecolari che regolano i rapporti struttura\/funzione\/stabilità delle proteine ipertermofile sia all’approfondimento delle conoscenze sulla struttura, sul ruolo e sul meccanismo catalitico della S-adenosilmetionina sintetasi da Archaea. Nel nostro laboratorio è stato identificato nel genoma di Pyrococcus furiosus, un archaeon ipertermofilo, l’ipotetico gene della S-adenosilmetionina sintetasi che è stato amplificato mediante PCR, inserito nel vettore di espressione pET-22b(+) ed espresso in E. coli BL21. Per la purificazione della S-adenosilmetionina sintetasi ricombinante è stata seguita una procedura rapida ed efficiente che sfrutta la estrema termostabilità dell’enzima ed utilizza come tappa chiave una cromatografia idrofobica su fenil-sepharoso. La proteina ricombinante è stata purificata ad omogeneità e ne sono state definite le principali caratteristiche chimico-fisiche e cinetiche. L’enzima è estremamente termofilo e termostabile, è caratterizzata da una stretta specificità di substrato ed è una proteina dimerica con una massa molecolare di 90 kDa.. "