Le nucleoside idrolasi (NH) sono glicosidasi che catalizzano l’idrolisi irreversibile del legame glicosidico di ribonucleosidi rilasciando la base azotata corrispondente ed il ribosio (1). Le NH comprendono una superfamiglia di metalloproteine strutturalmente e funzionalmente correlate inizialmente identificate in protozoi parassiti. Le NH partecipano alla via di recupero dei nucleotidi che è vitale in questi organismi che, a differenza della maggior parte degli organismi viventi, non posseggono gli enzimi per la sintesi de novo dei nucleotidi. Poichè nessuna attività nucleoside idrolasica né geni codificanti NH sono stati ritrovati finora in mammiferi, negli ultimi anni tali enzimi sono stati estensivamente studiati come interessanti potenziali bersagli per la sintesi di specifici inibitori ad azione chemioterapica più selettivi e meno tossici per l’ospite in grado di inibire o rallentare la crescita del parassita. La presenza di tre geni codificanti NHs nel genoma di E. coli ha recentemente aperto la questione sul loro ruolo fisiologico e funzionale nelle cellule batteriche, ed è stato postulato che tali enzimi potrebbero svolgere un ruolo altamente specializzato mediante il loro coinvolgimento nella degradazione di nucleosidi modificati del tRNA. Recentemente uno dei tre geni di E. coli, il gene yeiK, è stato clonato ed espresso e la proteina ricombinante è stata caratterizzata. La proteina yeiK è una nuova NH con una assoluta specificità per i nucleosidi pirimidinici inclusi i componenti del tRNA. E’ stato inoltre ipotizzato che questa NH, per la sua elevata efficienza catalitica nei confronti della 5-fluorouridina, un profarmaco con ridotta tossicità e un uptake facilitato, potrebbe essere utilizzata nella terapia genica anticancro. Sulla base di tali osservazioni, la caratterizzazione strutturale e funzionale di nuove NH come quelle da Archaea, potrebbe fornire non solo utili indicazioni sulla specificità di substrato, sul meccanismo catalitico e sulla funzione biologica di tali enzimi, ma anche permettere l’individuazione di nuove proteine da utilizzare in campo farmacologico. Nel nostro laboratorio sono stati identificati nel genoma di Sulfolobus solfataricus, un archaeon ipertermofilo, due ipotetici geni codificanti due nucleosidasi ad attività riboidrolitica i quali sono state amplificati mediante PCR, ed espressi in E. coli. I due enzimi sono stati purificati ad omogeneità e caratterizzati per quanto riguarda le principali proprietà chimico-fisiche (2-3). Entrambe le proteine sono termofile e termostabili. Esse differiscono nella specificità di substrato: una idrolizza esclusivamente i nucleosidi pirimidinici (SsCU-NH) e l’altra, più attiva, i nucleosidi purinici (SsIAG-NH). La conoscenza della struttura tridimensionale delle due NH da S. solfataricus ha contribuito a razionalizzare i dati che derivano dagli studi funzionali. In questa comunicazione riportiamo i dati ottenuti sulle strutture tridimensionali della SsIAG-NH e della SsCU-NH rispettivamente ad una risoluzione di 1.8 Å e di 1.6 Å. Dall’analisi dei cristalli è emerso che entrambi gli enzimi appartengono alle NH del gruppo I ed hanno una struttura quaternaria tetramerica. Le subunità monomeriche delle due NH sono molto simili fra loro mentre per quanto riguarda i siti attivi, nella SsCU-NH il Ca2+. risulta sostituito dal Na+. Due regioni proteiche sono apparentemente cruciali nel determinare la differente specificità di substrato dei due enzimi e precisamente il loop L1 e la porzione C-terminale dell’elica α9. L’utilizzo della mutagenesi sito-diretta ha permesso l’identificazione di un inaspettato residuo catalitico in entrambi i siti attivi e ha messo ulteriormente in luce il ruolo dei residui conservati in questa affascinante classe di enzimi.

STRUTTURA TRIDIMENSIONALE E SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO DI DUE RIBONUCLEOSIDE IDROLASI DALL’ARCHAEON IPERTERMOFILO SULFOLOBUS SOLFATARICUS

PORCELLI, Marina
2011

Abstract

Le nucleoside idrolasi (NH) sono glicosidasi che catalizzano l’idrolisi irreversibile del legame glicosidico di ribonucleosidi rilasciando la base azotata corrispondente ed il ribosio (1). Le NH comprendono una superfamiglia di metalloproteine strutturalmente e funzionalmente correlate inizialmente identificate in protozoi parassiti. Le NH partecipano alla via di recupero dei nucleotidi che è vitale in questi organismi che, a differenza della maggior parte degli organismi viventi, non posseggono gli enzimi per la sintesi de novo dei nucleotidi. Poichè nessuna attività nucleoside idrolasica né geni codificanti NH sono stati ritrovati finora in mammiferi, negli ultimi anni tali enzimi sono stati estensivamente studiati come interessanti potenziali bersagli per la sintesi di specifici inibitori ad azione chemioterapica più selettivi e meno tossici per l’ospite in grado di inibire o rallentare la crescita del parassita. La presenza di tre geni codificanti NHs nel genoma di E. coli ha recentemente aperto la questione sul loro ruolo fisiologico e funzionale nelle cellule batteriche, ed è stato postulato che tali enzimi potrebbero svolgere un ruolo altamente specializzato mediante il loro coinvolgimento nella degradazione di nucleosidi modificati del tRNA. Recentemente uno dei tre geni di E. coli, il gene yeiK, è stato clonato ed espresso e la proteina ricombinante è stata caratterizzata. La proteina yeiK è una nuova NH con una assoluta specificità per i nucleosidi pirimidinici inclusi i componenti del tRNA. E’ stato inoltre ipotizzato che questa NH, per la sua elevata efficienza catalitica nei confronti della 5-fluorouridina, un profarmaco con ridotta tossicità e un uptake facilitato, potrebbe essere utilizzata nella terapia genica anticancro. Sulla base di tali osservazioni, la caratterizzazione strutturale e funzionale di nuove NH come quelle da Archaea, potrebbe fornire non solo utili indicazioni sulla specificità di substrato, sul meccanismo catalitico e sulla funzione biologica di tali enzimi, ma anche permettere l’individuazione di nuove proteine da utilizzare in campo farmacologico. Nel nostro laboratorio sono stati identificati nel genoma di Sulfolobus solfataricus, un archaeon ipertermofilo, due ipotetici geni codificanti due nucleosidasi ad attività riboidrolitica i quali sono state amplificati mediante PCR, ed espressi in E. coli. I due enzimi sono stati purificati ad omogeneità e caratterizzati per quanto riguarda le principali proprietà chimico-fisiche (2-3). Entrambe le proteine sono termofile e termostabili. Esse differiscono nella specificità di substrato: una idrolizza esclusivamente i nucleosidi pirimidinici (SsCU-NH) e l’altra, più attiva, i nucleosidi purinici (SsIAG-NH). La conoscenza della struttura tridimensionale delle due NH da S. solfataricus ha contribuito a razionalizzare i dati che derivano dagli studi funzionali. In questa comunicazione riportiamo i dati ottenuti sulle strutture tridimensionali della SsIAG-NH e della SsCU-NH rispettivamente ad una risoluzione di 1.8 Å e di 1.6 Å. Dall’analisi dei cristalli è emerso che entrambi gli enzimi appartengono alle NH del gruppo I ed hanno una struttura quaternaria tetramerica. Le subunità monomeriche delle due NH sono molto simili fra loro mentre per quanto riguarda i siti attivi, nella SsCU-NH il Ca2+. risulta sostituito dal Na+. Due regioni proteiche sono apparentemente cruciali nel determinare la differente specificità di substrato dei due enzimi e precisamente il loop L1 e la porzione C-terminale dell’elica α9. L’utilizzo della mutagenesi sito-diretta ha permesso l’identificazione di un inaspettato residuo catalitico in entrambi i siti attivi e ha messo ulteriormente in luce il ruolo dei residui conservati in questa affascinante classe di enzimi.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/11591/211152
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