I nucleotidi giocano un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare. Essi sono i costituenti degli acidi nucleici, componenti essenziali di cofattori metabolici e messaggeri chimici, inoltre rappresentano la forma di energia che viene utilizzata dalla cellula. La maggior parte delle cellule viventi, mantiene adeguati livelli di nucleotidi mediante il bilancio tra biosintesi de novo e via di salvataggio dei nucleosidi e delle basi azotate. Nella via di salvataggio, le basi azotate ed i nucleosidi vengono convertiti in nucleosidi monofosfati, rispettivamente, dall’azione della fosforibosil-pirofosfatasi e della nucleoside chinasi. Sebbene le vie di salvataggio, differiscano nei diversi organismi, la tappa che coinvolge il rilascio delle basi dai nucleosidi è apparentemente conservata ed è catalizzata sia da nucleoside fosforilasi che da nucleoside idrolisi (NH). Le NH (EC 3.2.2-) sono glicosidasi calcio-dipendenti che catalizzano irreversibilmente l’idrolisi del legame N-glicosidico di -ribonucleosidi, rilasciando la base azotata corrispondente ed il ribosio (1). Poichè nessuna attività nucleoside idrolasica né geni codificanti NH sono stati ritrovati finora in mammiferi, e poiché i protozoi parassiti non posseggono gli enzimi per la sintesi de novo dei nucletidi, negli ultimi anni le NH sono state estensivamente studiate come interessanti potenziali bersagli per la sintesi di specifici inibitori ad azione chemioterapica più selettivi e meno tossici per l’ospite in grado di inibire o rallentare la crescita del parassita. Nel nostro laboratorio sono state identificate nel genoma di Sulfolobus solfataricus, un archaeon ipertermofilo, due ipotetici geni codificanti due nucleosidasi ad attività idrolitica i quali sono state amplificati mediante PCR, ed espressi in E. coli. I due enzimi sono stati purificati ad omogeneità e caratterizzati per quanto riguarda le principali proprietà chimico-fisiche (2-4). Esse differiscono nella specificità di substrato: la SsCU-NH idrolizza esclusivamente i nucleosidi pirimidinici mentre la SsIAG-NH, più attiva, i nucleosidi purinici. La determinazione della struttura tridimensionale delle due NH da S. solfataricus ha contribuito a razionalizzare i dati derivati dagli studi funzionali. Le strutture tridimensionali della SsIAG-NH e della SsCU-NH sono state determinate ad alta risoluzione (5). Dall’analisi dei cristalli è emerso che entrambi gli enzimi appartengono alle NH del gruppo I ed hanno una struttura quaternaria tetramerica. I monomeri delle due NH sono strutturalmente molto simili fra loro ma si differenziano per quanto riguarda i siti attivi, in quanto nella SsCU-NH il Ca2+ risulta sostituito dal Na+. La presenza inaspettata dello ione Na+, suggerisce un ruolo strutturale del metallo nel mantenimento della corretta geometria per le interazioni ottimali con il substrato. In SsCU-NH lo ione Na+ infatti svolge un ruolo fondamentale nella stabilizzazione dello stato di transizione e causa una differente interazione tra il ligando e la proteina. Due regioni proteiche sono apparentemente cruciali nel determinare la differente specificità di substrato dei due enzimi e precisamente i loops L1 e L3. Inoltre, la presenza delle catene laterali di Tyr221, Pro235, e Gln229 in SsCU-NH causa una riduzione del volume del sito attivo con una conseguente esclusione sterica delle basi puriniche (6). L'assenza di Tyr221 in SsIAG-NH invece, impedirebbe la sua attività sui substrati pirimidinici. La mutagenesi sito-diretta ha permesso l’identificazione di un residuo di istidina, differente da quello identificato nelle NH finora caratterizzate, coinvolto nella catalisi dei due enzimi da Archaea attraverso la stabilizzazione del gruppo uscente. Tale residuo l’His79 può svolgere quindi un duplice ruolo nel meccanismo catalitico nella classe enzimatica delle NH, modulando l'ingresso del substrato e il rilascio del prodotto negli isoenzimi che presentano il residuo His241 come la IU-NH da Crithidia fascicolata o agendo come donatore di protoni in quelli che non hanno tale residuo come le SsNH.

DALLA STRUTTURA DI DUE ISOENZIMI DA SULFOLOBUS SOLFATARICUS, UN ARCHAEON IPERTERMOFILO, ALLA IDENTIFICAZIONE DI NUOVI DETERMINANTI NEL MECCANISMO CATALITICO DELLE NUCLEOSIDE IDROLASI

PORCELLI, Marina
2012

Abstract

I nucleotidi giocano un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare. Essi sono i costituenti degli acidi nucleici, componenti essenziali di cofattori metabolici e messaggeri chimici, inoltre rappresentano la forma di energia che viene utilizzata dalla cellula. La maggior parte delle cellule viventi, mantiene adeguati livelli di nucleotidi mediante il bilancio tra biosintesi de novo e via di salvataggio dei nucleosidi e delle basi azotate. Nella via di salvataggio, le basi azotate ed i nucleosidi vengono convertiti in nucleosidi monofosfati, rispettivamente, dall’azione della fosforibosil-pirofosfatasi e della nucleoside chinasi. Sebbene le vie di salvataggio, differiscano nei diversi organismi, la tappa che coinvolge il rilascio delle basi dai nucleosidi è apparentemente conservata ed è catalizzata sia da nucleoside fosforilasi che da nucleoside idrolisi (NH). Le NH (EC 3.2.2-) sono glicosidasi calcio-dipendenti che catalizzano irreversibilmente l’idrolisi del legame N-glicosidico di -ribonucleosidi, rilasciando la base azotata corrispondente ed il ribosio (1). Poichè nessuna attività nucleoside idrolasica né geni codificanti NH sono stati ritrovati finora in mammiferi, e poiché i protozoi parassiti non posseggono gli enzimi per la sintesi de novo dei nucletidi, negli ultimi anni le NH sono state estensivamente studiate come interessanti potenziali bersagli per la sintesi di specifici inibitori ad azione chemioterapica più selettivi e meno tossici per l’ospite in grado di inibire o rallentare la crescita del parassita. Nel nostro laboratorio sono state identificate nel genoma di Sulfolobus solfataricus, un archaeon ipertermofilo, due ipotetici geni codificanti due nucleosidasi ad attività idrolitica i quali sono state amplificati mediante PCR, ed espressi in E. coli. I due enzimi sono stati purificati ad omogeneità e caratterizzati per quanto riguarda le principali proprietà chimico-fisiche (2-4). Esse differiscono nella specificità di substrato: la SsCU-NH idrolizza esclusivamente i nucleosidi pirimidinici mentre la SsIAG-NH, più attiva, i nucleosidi purinici. La determinazione della struttura tridimensionale delle due NH da S. solfataricus ha contribuito a razionalizzare i dati derivati dagli studi funzionali. Le strutture tridimensionali della SsIAG-NH e della SsCU-NH sono state determinate ad alta risoluzione (5). Dall’analisi dei cristalli è emerso che entrambi gli enzimi appartengono alle NH del gruppo I ed hanno una struttura quaternaria tetramerica. I monomeri delle due NH sono strutturalmente molto simili fra loro ma si differenziano per quanto riguarda i siti attivi, in quanto nella SsCU-NH il Ca2+ risulta sostituito dal Na+. La presenza inaspettata dello ione Na+, suggerisce un ruolo strutturale del metallo nel mantenimento della corretta geometria per le interazioni ottimali con il substrato. In SsCU-NH lo ione Na+ infatti svolge un ruolo fondamentale nella stabilizzazione dello stato di transizione e causa una differente interazione tra il ligando e la proteina. Due regioni proteiche sono apparentemente cruciali nel determinare la differente specificità di substrato dei due enzimi e precisamente i loops L1 e L3. Inoltre, la presenza delle catene laterali di Tyr221, Pro235, e Gln229 in SsCU-NH causa una riduzione del volume del sito attivo con una conseguente esclusione sterica delle basi puriniche (6). L'assenza di Tyr221 in SsIAG-NH invece, impedirebbe la sua attività sui substrati pirimidinici. La mutagenesi sito-diretta ha permesso l’identificazione di un residuo di istidina, differente da quello identificato nelle NH finora caratterizzate, coinvolto nella catalisi dei due enzimi da Archaea attraverso la stabilizzazione del gruppo uscente. Tale residuo l’His79 può svolgere quindi un duplice ruolo nel meccanismo catalitico nella classe enzimatica delle NH, modulando l'ingresso del substrato e il rilascio del prodotto negli isoenzimi che presentano il residuo His241 come la IU-NH da Crithidia fascicolata o agendo come donatore di protoni in quelli che non hanno tale residuo come le SsNH.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/11591/210561
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